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谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4FF

简要描述:TL504F 谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4FF
储存条件: 4℃保存,有效期至少一年。
外观(性状): 颗粒

  • 产品型号:TL504F
  • 厂商性质:生产厂家
  • 更新时间:2023-08-31
  • 访  问  量:158
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TL504F 谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4FF

储存条件: 4℃保存,有效期至少一年。
外观(性状): 颗粒

TL504F 谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4FF

产品简介:

pGEX载体表达的外源蛋白与谷胱甘肽S-转移酶融合,因此可以通过谷胱甘肽-琼脂糖亲和层析进行纯化。GSTs是一类以谷胱甘肽(γ-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸)作为底物,通过形成硫醇尿酸失活毒性小分子的酶。由于GST对底物的亲和力是亚毫摩尔级的,因此谷胱甘肽固化于琼脂糖形成的亲和层析树脂对GST及其融合蛋白的纯化效率很高。可以用含游离谷胱甘肽的缓冲液洗脱结合GST融合蛋白。树脂用3mol/L NaCl的缓冲液再生。谷胱甘肽琼脂糖对GST融合蛋白的结合能力很强(每毫升柱床体积的树脂能结合8毫克融合蛋白)。

特性: 粒度:45-165µm 流速:1875px/h           工作PH4-10 耐压:0.3Mpa载量:>10mg 谷胱甘肽 S-转移酶

使用说明:

谷胱甘肽树脂的处理:

1. 轻轻颠倒盛有谷胱甘肽-琼脂糖树脂的容器,将树脂混成匀浆。

2. 取部分匀浆放入15mL聚丙烯管(每100mL 细菌培养物大约需要2mL 匀浆)。

3. 4℃ 500 g离心5分钟,小心去掉上清。

4. 在树脂中加入10倍柱床体积预冷的PBS,颠倒数次混匀,4℃ 500 g离心5分钟,小心去掉上清。

5. 每毫升树脂加入1毫升冷的PBS,制成50%匀浆,颠倒数次,混合均匀,悬液冰上放置待用。制备细胞抽提物:

6. 每100毫升培养物的细胞沉淀重悬于4mL PBS缓冲液中。

7. 加入溶菌酶至终浓度为1mg/mL,冰上放置30分钟。

8. 用针筒将10mL 浓度为0.2%TritonX-100 ,强行注入黏稠的细胞裂解物中,剧烈振动数次混匀。加入DNaseRNase至终浓度5ug/mL, 4℃振动温育10分钟,4℃ 3000 g离心30分钟,去除不溶性细胞碎片,上清转移到一只新管中,加入DTT至终浓度1mmol/L纯化融合蛋白

9. 细胞裂解物与适量50%谷胱甘肽-琼脂糖树脂匀浆混和,每100毫升细菌培养物加2mL树脂,于室温轻摇30min

10. 混合物于4℃500 g离心5分钟,小心去掉上清并留样少许进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。

 

1. 沉淀中加入10倍柱床体积的冷的PBS,颠倒离心管数次混匀,洗去未与树脂结合的蛋白。

2. 4℃500 g离心5分钟,小心去掉上清并留样少许进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。

3. 重复步骤1112两次。

4. 结合的GST融合蛋白可用谷胱甘肽洗脱液洗脱,也可用凝血酶、肠激酶或Xa 因子切割,释放靶蛋白。

用谷胱甘肽洗脱融合蛋白:

5. 沉淀中加入1倍柱床体积的谷胱甘肽洗脱缓冲液,室温轻轻搅动10min,洗脱树脂上结合的蛋白。

6. 4℃500 g离心5分钟,上清(含洗脱的融合蛋白)移至新管中。

7. 重复步骤ab两次,合并3次上清。蛋白酶解从结合的GST融合蛋白上回收靶蛋白:

8. 在结合了融合蛋白的树脂中加入凝血酶、肠激酶或Xa 因子(根据融合蛋白中的位点选择),每mL树脂加入50单位溶于1mLPBS的蛋白酶。颠倒离心管数次混匀,室温下振荡2—16小时。用小规模实验确定精确时间。

9. 4℃500 g离心5分钟,上清小心移至新管中。(GST仍结合在树脂上,而靶蛋白在上清中,蛋白酶也在上清中,仍需要分离)

10. 10% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析每一步样品的蛋白质组成。试剂配制:谷胱甘肽洗脱缓冲液10mmol/L还原型谷胱甘肽,50mmol/L Tris-Cl (pH8.0)

TL504F 谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4FF

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